一、摘要

佐剂（Adjuvant）又称免疫调节剂或免疫增强剂，它能够增强机体对抗原的免疫应答或者改变免疫类型。早在20世纪20年代，Ramon在对马匹接种白喉毒素时，接种部位产生了一个脓肿，此处的特异性抗体滴度较高，随后发现脓肿是注射了不相关的物质所产生的，此物质增加了抗类毒素的免疫反应，由此便提出了“佐剂”的概念。此后随着新型疫苗技术逐渐成熟，如重组蛋白疫苗、裂解疫苗、亚单位疫苗等新型疫苗的出现，极大地推动了现代新型佐剂的发展。

目前批准使用的人用疫苗佐剂主要包括：氢氧化铝和磷酸铝等铝盐类佐剂，MF59和AS03等水包油乳剂，AS04和RC-529等以MPL（单磷酰脂质A）为基础的佐剂，以及流感病毒virosome等（表1）。

表1. 已上市疫苗佐剂统计

其中，铝盐作为疫苗佐剂已有近90年的历史。时至今日，一直是唯一获准广泛用于人用疫苗的佐剂。铝佐剂因其辅佐机制相对清楚，安全、有效，耐受性相对较好，且在应对突发疫情以及开发新型疫苗中扮演着重要角色。故铝佐剂仍将是今后长时期内最为广泛使用的人用疫苗佐剂，是佐剂疫苗生产的关键工艺技术！

二、铝佐剂的分类及特性

铝佐剂主要包括磷酸铝［Al(OH)x (PO4)y］、氢氧化铝［Al(O)OH］和硫酸铝钾［KAl(SO4)2·12H2O］3 种，目前常用的铝佐剂为氢氧化铝和磷酸铝。

铝佐剂表面均含有亲水基团，如羟基、氧或磷酸盐基团，其表面所带电荷由 pH 决定。

氢氧化铝是一种表面只有羟基基团的层状晶体，因其羟基可提供或接收质子，从而表现为两性化合物，在 pH 7. 4 的溶液中以阳离子形式存在，是阴离子抗原的良好吸附剂。

磷酸铝佐剂是羟基磷酸铝复合物，为无定形结构，它不是一种整比化合物，羟基和磷酸盐之间无固定比例。磷酸基团对羟基的置换程度取决于反应物和沉淀的条件及其等电点，在 pH 7. 4 的溶液中以阴离子形式存在，是阳离子抗原的良好吸附剂。

不同的铝盐具有不同的等电点，氢氧化铝、磷酸铝的等电点分别为11.4和5。总体来说，蛋白抗原（尤其酸性蛋白抗原）、病毒类抗原大多采用氢氧化铝佐剂，如在乙肝、百白破三联疫苗等广泛使用氢氧化铝作为免疫佐剂。少量蛋白抗原及蛋白多糖结合抗原采用磷酸铝佐剂，如多价肺炎结合疫苗较多使用羟基磷酸铝作为免疫佐剂。

三、铝佐剂作用机理

铝佐剂虽应用于人用疫苗多年，但其作用机制较为复杂，铝佐剂常同时激活多个免疫反应链，与抗原特异性免疫应答相关的反应链难以单独分析其作用。从效果上讲可能包括以下作用：①抗原储存和稀释作用：铝佐剂吸附抗原后，增加抗原的表面积，充分暴露抗原表面结合位点，缓慢释放抗原，提高抗体应答，增强抗原的免疫原性，刺激抗原呈递，促进细胞因子分泌，加强T细胞和B细胞的系统作用，在较长时间内持续刺激免疫细胞，从而维持有效免疫应答过程并最终产生良好的免疫记忆。②靶向抗原：同时含有铝佐剂和抗原的纳米颗粒，一方面通过交联BCR更容易激活B细胞，更重要的是纳米颗粒更容易靶向具有吞噬功能的抗原提呈细胞。③局部炎症反应：铝佐剂能够在注射部位引起无菌性炎症，大量先天性和获得性免疫细胞被招募到注射部位和邻近的引流淋巴结，其中大量细胞将介导随后发生的疫苗抗原特异性免疫应答。

四、铝佐剂生产难点及解决方案

1. 生产用原材料及质量控制

铝佐剂制备的原材料为无机盐，原则上应符合《中国药典》“生物制品生产用原材料和辅料质量控制规程”相关规定。

2. 制备及生产工艺

严格的质量属性设计和工艺参数设计是工艺开发的重要前提。铝佐剂的工艺开发可参照ICH Q8[1]等国际通行原则，以铝佐剂和/或疫苗的候选关键质量属性确定工艺路线、工艺参数并明确工艺过程控制策略。

在铝佐剂制备工艺中，一般将铝佐剂颗粒的粒径大小、粒径分布一致性，以及对抗原的高吸附能力作为产品质量及稳定性的重要指标，它也是影响着机体发生免疫应答反应的重要因素[2]。铝佐剂颗粒越小，比表面积越大，表面反应活性越高，对抗原的吸附率也越高，能更好地对抗原提取、转运及与抗原相互作用[3]。研究表明小鼠对粒径细小的磷酸铝的耐受性也更好。

通常认为小于10μm为优化粒径，目前商业化的氢氧化铝佐剂Alhy-drogel®的粒径为3.07μm，磷酸铝佐剂Adju-phos®的粒径为4.26μm。

基于以上思考，在如图1所示的铝佐剂生产流程中，需要对制备工艺参数如：反应温度、反应pH控制、搅拌控制、反应物料的加入方式，超滤换液以及无菌处理等方面进行重点考量。

01 反应物选择

制备Al(OH)3佐剂的方法有2种，一种是氨水法，即三氯化铝（AlCl3）与氨水反应，生成Al(OH)3胶体。另一种是三氯化铝与氢氧化钠反应生成Al(OH)3，后者在生产上较为常见。研究结果显示：三氯化铝加氢氧化钠的配制工艺简捷，易控制工艺参数及佐剂质量，对疫苗效力的增强作用优于三氯化铝加氨水的配方[4] 。而制备磷酸铝佐剂则使用铝盐溶液与磷酸盐溶液体系反应生成磷酸铝佐剂，反应过程需对反应物浓度配比进行精确控制。

02 反应温度控制

研究表明：当反应温度在58~62℃时，Al(OH)3胶体颗粒不稳定，在后续高温灭菌后容易出现大颗粒沉淀，而当反应温度在70~72℃时，Al(OH)3胶体颗粒稳定，高温灭菌后浊度好[5]。在不同混合温度制备磷酸铝佐剂时，所得佐剂的粒径分布结果显示，75℃制备的磷酸铝颗粒粒径略大于在65℃下制备的佐剂粒径，两者明显比室温下制备佐剂的颗粒更细密均匀[6]。故我们在佐剂实际生产过程中需严格把控反应过程温度。佐剂反应罐的控温可采用温控单元对反应温度进行精准控制，应避免反应温度过快，过高。

03 反应pH控制

由于磷酸铝佐剂是一种无定形羟基磷酸铝盐，羟基和磷酸盐之间无固定比例，因此沉淀时pH控制会影响羟基与磷酸基团比例，在较高pH情况下羟基浓度的增加能使羟基例子更有效地竞争铝周围的配位点，而在较低pH情况下沉淀则较有利于Al-PO4键的形成，而非Al-OH键。这样，基团不同将导致聚集改变，进而影响粒径大小。并且佐剂表面不同基团的暴露也会导致吸附蛋白的种类和能力会产生较大差别。研究表明，一些抗原在pH低于6的条件下可很好的被吸附到铝佐剂表面[7]，pH值偏离此范围，额外的离子则通过与抗原竞争吸附位点，从而减少抗原吸附，如磷酸基团、氨基酸、肽段、多糖等杂质。总的来说，离子强度低、磷酸基团少、杂质少的情况下有助于抗原吸附到铝佐剂表面。因此，为了生产均一的磷酸铝佐剂，在沉淀时应保持pH值稳定，pH太高将导致后面灭菌过程中大量Al(OH)3胶体不稳定而产生大颗粒沉淀，将给后续换液提纯工艺造成较大困难，而pH太低，成分将不合格，影响佐剂性能。故铝佐剂的制备需要时刻监视pH变化，物料添加要稳定流速，反应过程要均匀，避免局部反应过快。

04 物料添加方式

在大型生产中，物料的添加常采用“精密质量流量计+控制阀”的控制方式。小型制备系统则可选用高稳定隔膜泵或匀流蠕动泵配合高精度质量流量计来进行精准控制。为避免局部反应过快，可以在物料进罐前使用定制静态混合器或者动态混合器进行均匀、充分地反应，这样可以避免出现物料直接加入罐内后各部分反应状态的不同。物料添加也可以实现一种反应物料以多点喷嘴或多点滴加的方式加入到另一种反应物料中，并根据物料加入速率控制好搅拌速率，这样获得的铝佐剂粒径小，一致性较好。

05 超滤换液

超滤换液的目的主要是通过改变铝佐剂缓冲体系，去除游离的磷酸根离子或铝离子，减少离子强度，获得高纯度的铝佐剂。并且缓冲体系可通过改变佐剂的等电点来增强佐剂对抗原的吸附能力[8]。另外，良好的缓冲体系可使铝佐剂长时间保存而不聚集。

06 无菌处理

采用佐剂自动化无菌处理系统，需关注对佐剂质量及颗粒聚集的影响。整个无菌制备系统采用全卫生型设计。且佐剂分装应为无菌分装系统。另外，应对佐剂制备、使用过程的无菌保障控制进行全面的风险评估和验证。

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本文参考文献：

1. Pharmaceutical Development， ICH Q8，2009

2. GUOTA R K. Aluminum compounds as vaccine adjuvants［J］. Adv Drug Deliv Rev，1998，32：155-172

3. CHEN Y L. Preperation of aluminum （oxy）hydroxide nanorods adjuvant and its immune effects of adsobing Pseudomonas Aeruginosa ［D］. Chongqing：Chongqing University，2019. （in Chinese）

4.  叶琳,刘敦原. 两种配方的氢氧化铝吸附基因工程乙肝疫苗的效果比较[J]. 微生物学免疫学进展, 1999, 27(4): 51

5. 李德娟,何巍. 氢氧化铝佐剂配制工艺的优化[J]. 中国生物制品学杂志, 2010, 23(10): 1136

6. 韩露. 铝佐剂的制备及其在吸附无细胞百白破疫苗和重组肺炎蛋白疫苗中的应用[A]. 2015 : 26-27

7.  LINDBLAD E B. Aluminum adjuvants// STEWAR-TULL D E S. The theory and practical application of adjuvants[M]. Chichester: John Willey and Sons Ltd，1995：21-35

8.  岳卓,赵玉秀. 铝佐剂的特性及其研究进展[J].中国生物制品学杂志, 2016, 29(12): 1352

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